培養細胞的冷凍保存與復蘇

 

n       概述	²      凍存過程
n       冷凍保存與復蘇的原理	²      凍存結果
¨      冷凍速率	²      討論
¨       冷凍保存溫度	n       凍存細胞的復蘇
¨       復溫速率	¨       非玻璃化凍存細胞的復蘇
¨       冷凍保護劑	²     主要材料
n       冷凍保存方法	²      復蘇過程
¨      非玻璃化凍存方法	²      結果
²     主要材料	²      討論
²      凍存過程	¨       玻璃化凍存細胞的復蘇
²      凍存結果	²      主要材料
²      討論	²      復蘇過程
¨       玻璃化凍存方法	²      結果
²     主要材料	²      討論

  
n       概述 
Spallanzani（1776）**早發表了冷“處理”對“細胞”生命活動影響的報道，他用雪冷凍玻璃瓶中的馬精子10多分鐘之后，再將玻璃瓶放回室溫下，發現了一個令人驚奇的現象，那些原本已經不動了的精子又“復活”了，就好象是剛從輸精管排出來的一樣，冷處理延長**數十分鐘，情況依然如此。于是，他認為冷不能殺死精子。大約100年以后，許多早期的學者重復了低溫處理對精子活動的影響，同樣得出了相似的結論。到1900年前后，科學家基本上肯定了生物成分（如精子和一些生物化學物質）能夠在零下溫度貯存的事實。 
Shettles（1940）證明人類的精子也能抵抗溫度的突然變化，他將人的精液封閉在小管內，在-79⁰C～-196⁰C之間的低溫條件下進行冷處理，發現有10%的精子仍然能夠存活。此后，冷凍處理研究材料的范圍大大拓展。 
Polge等人（1949）發現了甘油對低溫下貯存的細胞具有保護作用，他們仍然以精子進行研究發現，加入甘油能夠大大提高貯存于-79⁰C下精子的存活率。接下來的重大進展是Luyet（1951）與Lovelock（1953）等多位學者發現了電解質濃度對貯存細胞的損傷作用。他們的結論是，電解質濃度增大是造成貯存細胞損傷的主要原因。冷凍理論后來得到Merryman（1956）、Rey（1957）以及Smith（1961）等學者的繼續和發展。 
1949年**1960年這一段時間可以稱為冷凍保存的“甘油時期”，這一時期對生物材料的冷凍保存一般都是以甘油作為保護劑。Lovelock（1959）等人發現了一種新的化學保護劑，這就是人們熟悉的二甲基亞砜（DMSO）。而且，用于冷凍保存的儀器也有明顯的發展。目前，無論是冷凍保存理論、各種保護劑、冷凍用品和設備以及各種生物材料的保存與復蘇技術都已十分成熟和完備。 
  冷凍保存與復蘇原理 
在低于-70⁰C的超低溫條件下，有機體細胞內部的生化反應極其緩慢，甚**終止。因此，采取適當的方法將生物材料降**超低溫，即可使生命活動固定在某一階段而不衰老死亡。當以適當的方法將凍存的生物材料恢復**常溫時，其內部的生化反應可恢復正常。所謂冷凍保存，就是將體外培養物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降**零下某一溫度（一般是低于-70⁰C的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。而復蘇就是以一定的復溫速率將凍存的體外培養物或生物活性材料恢復到常溫的過程。不論是微生物、動物細胞、植物細胞還是體外培養的器官都可以進行凍存，并在適當條件下復蘇。 #p#分頁標題#e#
水在低于零度的條件下會結冰。如果將細胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細胞內外的水分都會結冰，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞而引起細胞死亡。這種因細胞內部結冰而導致的細胞損傷稱為細胞內冰晶的損傷。如果將細胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細胞外部的水分會shou先結冰，從而使得未結冰的溶液中電解質濃度升高。如果將細胞暴露在這樣高溶質的溶液中且時間過長，細胞膜上脂質分子會受到損壞，細胞便發生滲漏，在復溫時，大量水分會因此進入細胞內，造成細胞死亡。這種因保存溶液中溶質濃度升高而導致的細胞損傷稱為溶質損傷或稱溶液損傷。當溫度進一步下降，細胞內外都結冰，產生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護劑，則可保護細胞免受溶質損傷和冰晶損傷。因為冷凍保護劑容易同溶液中的水分子結合，從而降低冰點，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結冰溶液中電解質的濃度，使細胞免受溶質損傷，細胞得以在超低溫條件下保存。在復蘇時，一般以很快的速度升溫，1-2分鐘內即恢復到常溫，細胞內外不會重新形成較大的冰晶，也不會暴露在高濃度的電解質溶液中過長的時間，從而無冰晶損傷和溶質損傷產生，凍存的細胞經復蘇后仍保持其正常的結構和功能。冷凍保護劑對細胞的冷凍保護效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復溫速率有關。而且不同的冷凍保護劑其冷凍保護效果也不一樣。 
  冷凍速率 
冷凍速率是指降溫的速度，直接關系到冷凍效果。細胞在冷凍過程中會發生如下變化：當細胞被冷**-5⁰C時，因溶液中加有冷凍保護劑而降低溶液的冰點，細胞內外溶液仍未結冰；當被冷**-5～-15⁰C之間時，細胞外溶液先出現結冰而細胞內仍保持未結冰狀態。細胞內未結冰的水分子會比細胞外部分結冰溶液中的水分子具有更高的化學能。其結果是，細胞內水分子為了和細胞外水分子保持化學能的平衡，會向細胞外流動。冷凍速度不同，細胞內水分向外流動的情況也不相同：如果冷凍速度慢，細胞內水分外滲多，細胞脫水，體積縮小，細胞內溶質濃度增高，細胞內不會發生結冰；如果冷凍速度快，細胞內水分沒有足夠的時間外滲，結果隨著溫度的下降而發生細胞內結冰；如果冷凍速度非常快（即超快速冷凍），則細胞內形成的冰晶非常小或不結冰而呈玻璃狀態（玻璃化冷凍）。Luyet（1973）證實液體的凝固可分為兩種形式：一種是晶體化，溶液中的分子呈有序排列；另一種情況是非晶體即玻璃化，液體中的分子呈無序狀態，保持未凝固前的狀態。 
不同的冷凍速度既然能使細胞內發生不同的生理變化，也可以對細胞產生不同的損傷。當冷凍速度過慢時，細胞脫水嚴重，細胞體積嚴重收縮，超過一定程度時即失去活性。同時冷凍速度過慢，還會引起細胞外溶液部分結冰，從而使細胞外未結冰的溶液中溶質濃度增高，產生溶質損傷。當冷凍速度過快時，細胞內水分來不及外滲，會形成較到冰晶，造成細胞膜及細胞器的破壞，產生細胞內冰晶損傷。超快速玻璃化冷凍對細胞存活來說是**為理想的冷凍方法。細胞內外呈玻璃化凝固，無冰晶形成或形成很小的冰晶，對細胞膜和細胞器不致造成損傷，細胞也不會在高濃度的溶質中長時間暴露而受損。 
不同細胞的**適冷凍速率不同。小鼠骨髓干細胞、酵母、人紅細胞的**適冷凍速率分別為1.6⁰C/min、7⁰C/min和200⁰C/min。細胞與細胞之間的**適冷凍速率可在1.6⁰C～300⁰C/min，故對一種細胞進行冷凍保存之前，shou先需要測定其**適冷凍速率，以保證獲得**高的冷凍存活率。 
  冷凍保存溫度 
冷凍保存溫度是指能長期保存細胞的超低溫度，在此溫度下，細胞生化反應極其緩慢甚**停止，但經過長期保存，在復蘇后仍能保持正常的結構和功能。
不同的細胞和生物體以及使用不同的冷凍保存方法要取得同樣的冷凍保存效果，冷凍保存溫度可以不同。但從實際和效益的觀點出發，液氮溫度（-1960C）是 目前**佳的冷凍保存溫度。在-1960C時，細胞的生命活動幾乎完全停止，但復蘇后細胞的結構和功能完好。如果冷凍過程得當，一般生物樣品在-1960C下均可保存十年以上。應用-700C～-800C保存細胞，短期內對細胞的活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細胞存活率明顯降低。在冰點到-400C范圍內保存細胞的效果不佳。
  復蘇速率 
    冷凍保護體外培養物，除了必須有**佳的冷凍速率、合適的冷凍保護劑和凍存溫度外，在復蘇時也必須有**佳的復溫速率，這樣才能保證**后獲得**佳冷凍保存效果。 
復溫速率是指在細胞復蘇時溫度升高的速度。復溫速率不當也會降低凍存細胞存活率。一般來說，復溫速度越快越好。常規的做法是，在37⁰C水浴中，于1-2分鐘內完成復蘇。復溫速度過慢，細胞內往往重新形成較大冰晶而造成細胞損傷。復溫時造成的細胞損傷非常快，往往在極短的時間內發生。 
冷凍保護劑 
冷凍保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質。冷凍保護劑常常配制成一定的溶液。一般來講，只有紅細胞、大多數微生物和極少數有核的哺乳動物細胞懸浮在不加冷凍保護劑的水或簡單的鹽溶液中，并以**適的冷凍速率冷凍，可以獲得活的凍存物。但對于大多數有核哺乳動物細胞來說，在不加冷凍保護劑的情況下，無**適冷凍速率可言，也不能獲得活的冷凍物。例如將小鼠骨髓細胞懸浮在不加冷凍保護劑的平衡鹽溶液中，并以0.3～600#p#分頁標題#e#⁰C/min的冷凍速率降溫冷凍，98%以上的細胞會死亡；而加入甘油冷凍保護劑進行冷凍保存時，98%以上的細胞都可存活。 
冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性冷凍保護劑可以滲透到細胞內，一般是一些小分子物質，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護機制是在細胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細胞內，在細胞內外產生一定的摩爾濃度，降低細胞內外未結冰溶液中電解質的濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質的損傷，同時，細胞內水分也不會過分外滲，避免了細胞過分脫水皺縮。甘油和DMSO并不防止細胞內結冰，在使用該類冷凍保護劑時，需要一定的時間進行預冷，讓甘油或DMSO等成分滲透到細胞內，在細胞內外達到平衡以起到充分的保護作用。目前DMSO的應用比甘油更為廣泛，但要注意的是，DMSO在常溫下對細胞的毒性作用較大，而在4⁰C時，其毒性作用大大減弱，且仍能以較快的速度滲透到細胞內。所以，凍存時DMSO平衡多在4⁰C下進行，一般需要40～60分鐘。 
非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是些大分子物質，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。其保護機制的假說很多，其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質可以優先同溶液中水分子結合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成；同時，由于其分子量大，使溶液中電解質濃度降低，從而減輕溶質損傷。 
不同的冷凍保護劑有不同的優、缺點。目前一般多采用聯合使用兩種以上冷凍保護劑組成保護液。由于許多冷凍保護劑（如DMSO）在低溫下能保護細胞，但在常溫下卻對細胞有害，故在細胞復溫后應及時洗滌冷凍保護劑。 
      冷凍保存方法 
按照冷凍保護液在凍結后是否形成冰晶來劃分，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種。非玻璃化凍存是利用各種溫級的冰箱分階段降溫**-70⁰C～-80⁰C，然后直接投入液氮進行保存；或者是利用電子計算機程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降**-100⁰C以下，再直接投入液氮保存的方法。以該種方法凍結的細胞懸液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化凍存則是指利用多種高濃度的冷凍保護劑聯合形成的玻璃化冷凍保護液保護懸浮細胞，直接投入液氮進行凍存的方法。以該中方法凍結的細胞懸液沒有冰晶的形成。但目前細胞凍存**常用的仍是前一種方法。 
 非玻璃化凍存方法 
下面以腫瘤細胞和雜交瘤細胞為例，介紹非玻璃化凍存細胞的詳細過程。 
 主要材料 
（1）儀器設備：普通冰箱、-30⁰C低溫冰箱和-70⁰C～-80⁰C超低溫冰箱、液氮凍存罐、高速離心機、電子計算機程控降溫儀等； 
（2）凍存管：容量為1ml或1.5ml； 
（3）冷凍保護液：一般是以9份小牛血清或細胞培養液與1份DMSO混合而成。現配現用，或配制后防入普通冰箱冰盒內冷凍保存。使用前，于室溫下水浴溶解； 
（4）待凍存細胞：各種腫瘤細胞或雜交瘤細胞。 
操作過程 
1.      待凍存細胞懸液的制備 
(1)     按常規方法消化處于對數生長期的細胞培養物，制備單細胞懸液，并計算細胞總數； 
(2)     將細胞懸液以800～1000r/min離心5min，去上清夜； 
(3)     向細胞沉淀物中加入冷凍保護液，輕輕吹打混勻，使細胞密度達1×106～1×107個/ml； 
(4)     按每管1～1.5ml的量分裝于凍存管內，擰緊管蓋； 
(5)     再凍存管上做好標記，包括細胞代號及凍存日期。 
2.      分級冷凍 
(1)     先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（4～8⁰C），約40min； 
(2)     接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室（-10⁰C～-20⁰C），約30～60min； 
(3)     將凍存管轉入低溫冰箱（-30⁰C），放置30min左右； 
(4)     然后將凍存管轉移到超低溫冰箱（-70⁰C～-80⁰C），過夜； 
(5)     **后將凍存管投入液氮保存。 
3.        記錄 
做好凍存記錄。記錄內容包括凍存日期、細胞代號、凍存管數、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。 
 凍存結果 
如此凍存的細胞，其存活率可達90%以上。 
 討論 
在使用DMSO前，不要對其進行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。高壓滅菌反而會破壞其分子結構，以致降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有毒，故在配制時**好帶手套。 
在將細胞凍存管投入液氮時，動作要小心、輕巧，以免液氮從液氮罐內濺出。若液氮濺出，可能對皮膚造成凍傷。操作過程中**好帶防凍手套、面罩、工作衣或防凍鞋。 
應注意控制凍存細胞的質量。既要在凍存前保障細胞具有高活力，還要確保無微生物污染，這樣的細胞才具有凍存價值。另外，在每批細胞凍存一段時間后，要復蘇1～2管，以觀察其活力以及是否受到微生物的污染。 #p#分頁標題#e#
凍存管宜采用塑料凍存管，不宜使用玻璃安瓿。因為在復蘇時，需要從-196⁰C的液氮中取出凍存管，立即投入37～40⁰C溫水中，溫差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而發生危險。 
  玻璃化凍存方法 
以下以人單核細胞為例說明這種細胞凍存方法（Takhashi et al. 1986）。 
 主要材料 
（1）冷凍保護液：為Hanks平衡鹽溶液加入20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr 8000）而成。用2 mol/L NaOH調節pH**7.4，現配現用。 
（2）凍存管：SILASTIC玻璃小管，內徑3mm，外徑4.5mm； 
（3）設備：液氮儲存罐； 
（4）待凍存細胞：人類外周血單核細胞。 
 凍存過程 
（1）    用常規方法分離全血中單核細胞； 
（2）    在冰浴中預冷冷凍保護液； 
（3）    將裝有單核細胞的離心管放置入盛有冰水的燒杯內（冰浴）； 
（4）    沿離心管壁緩慢滴加預冷的冷凍保護液。滴加過程為：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的凍存液以0.75ml/min速度滴加。2×10⁷個細胞要滴加15ml凍存液。滴加的時間在15min左右。**終細胞密度要在1×10⁶～1.5×10⁶個細胞/ml，邊滴加邊輕輕晃動離心管； 
（5）    輕輕吹吸混勻細胞冷凍懸液； 
（6）    將細胞冷凍懸液分裝于凍存管中。12cm長的凍存管裝0.8ml細胞冷凍懸液； 
（7）    將凍存管兩端以火焰封口； 
（8）    **后將凍存管直接投入液氮中保存。降溫速度約為600⁰C/min。 
凍存結果 
如此凍存的細胞，其存活率可達90%以上。 
 討論 
    玻璃化凍存法對細胞活性的保存具有較好的效果，不需要復雜的儀器設備，具有液氮儲存設備即可使用。目前，該方法已在胚胎冷凍方面得到廣泛應用，但很少應用于一般細胞的凍存。這可能與需要配制較復雜的凍存液以及冷凍前和復蘇后較煩瑣的操作有關。 
因為玻璃化冷凍保護液中的冷凍保護劑的濃度較高，室溫下對細胞具有毒性（但在4⁰C時毒性大為減弱）。所以，冷凍保護液的滴加全過程必須在4⁰C冰浴中進行。另外，滴加速度要緩慢，如果滴加速度過快，則在細胞外產生很高的滲透壓，造成細胞膜的損傷，導致細胞死亡，故要緩慢滴加，讓冷凍保護劑有足夠的時間緩慢滲透到細胞內，達到細胞內外的平衡。 
凍存細胞的復蘇 
¨       非玻璃化凍存的復蘇方法  
 主要材料 
    （1）    儀器設備：恒溫水浴箱、高速離心機； 
    （2）    培養用液：完全培養液。 
   復蘇過程 
（1）    調配37⁰C～40⁰C的溫水，或將恒溫水浴箱的溫度調節**37⁰C～40⁰C； 
（2）    從液氮中取出凍存管，立即投入37⁰C～40⁰C 溫水中迅速晃動，直**凍存液完全溶解； 
（3）    將細胞凍存懸液轉移到離心管內，加入約5ml培養液，輕輕吹打混勻； 
（4）    將細胞懸液經800～1000r/min離心5min，棄上清夜； 
（5）    向細胞沉淀內加入完全培養液，輕輕吹打混勻，將細胞懸液轉移到培養瓶內，補足培養液進行培養。 
  結果 
復蘇后的細胞應該保持其凍存時的活力，活細胞數達90%以上。 
    討論 
    細胞凍存懸液一旦融解后，要盡快離心除去冷凍保護液，防止冷凍保護劑對細胞產生毒性。實驗人員在復蘇細胞過程中，同樣應具有自我保護意識，避免被液氮凍傷。 
      玻璃化凍存的復蘇方法 
以下以人的單核細胞為例說明其過程（Takhashi et al. 1986）。 
  主要材料 
（1）設備：高速離心機； 
（2）培養用液：添加20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液、培養液。 
 操作過程 
(1)     將凍存管從液氮中取出，立即投入冰浴中5min。復溫速率約560⁰C/min。一次可以進行多個凍存管的復蘇； 
(2)     將凍存管兩端剪斷，可以將5ml細胞凍存懸液轉移到50ml離心管中； 
(3)     沿離心管壁緩慢加入已在冰浴中預冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液。前10min以0.2ml/min的速度加入，后10min以0.5ml/min的速度加入，接著的15min以0.75ml/min的速度加入，**后30min以1ml/min的速度加入。全過程約為65min，都在冰浴中進行； 
(4)     將稀釋后的細胞懸液以400r/min離心5min，去除上清。向細胞沉淀中加入培養液重新懸浮細胞，用于培養。 
 結果 
復蘇后的細胞應該保存其凍存時的活力，活細胞數達90%以上。 #p#分頁標題#e#
   討論 
復蘇時，冷凍保護液的稀釋及去除過程與凍存前冷凍保護液的滴加過程一樣，不能在室溫下而必須在4⁰C冰浴中進行，避免在室溫下冷凍保護劑對細胞產生毒性。稀釋過程也要緩慢進行，保證有足夠的時間讓冷凍保護劑從細胞內滲出，以達到細胞內外的平衡，避免高滲透壓的損傷。